1 中国医学科学院和中国协和医科大学药物研究所天然药物活性物质和功能国家重点实验室，北京 100050；

youshen@imm.ac.cn (新加坡)；wangmingjin@imm.ac.cn (m .-j . w .)；houzhenyan@imm.ac.cn (z .-y . h .)；wangweida@imm.ac.cn (w .-d . w .)；ninadu@imm.ac.cn (t .-t . d .)；

angelnina@imm.ac.cn (N.-N.X .)

2 北京药物研究所新药机制与药理评价研究重点实验室

中国医学科学院和中国协和医科大学医学研究所，北京 100050

3 中国医学科学院小分子免疫肿瘤药物研发重点实验室，北京 100050

*通信:jiming@imm.ac.cn (mj .)；chxg@imm.ac.cn (X.-G.C .) 这些作者对这项工作做出了同等贡献。

摘要背景:绿原酸具有显著的生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用。然而，CHA在神经母细胞瘤中的药理作用尚未得到评估。神经母细胞瘤是一种在未分化的交感神经节细胞中发展的癌症。本研究旨在评估CHA对神经母细胞瘤的抗肿瘤活性并揭示其在细胞分化中的作用机制。方法:用Be(2)- M17和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞确认分化表型。皮下和原位异种移植小鼠模型也用于评价CHA的抗肿瘤活性。海马分析和代谢组学分析进一步研究CHA及ACAT1在线粒体代谢中的作用。结果:CHA在体内外均可诱导Be(2)-M17和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的分化。CHA抑制的线粒体ACAT1的敲低也导致了体内和体外的分化特征。代谢组学分析显示，硫胺素代谢参与神经母细胞瘤细胞的分化。

结论：这些结果提供了CHA通过诱导分化对神经母细胞瘤表现出良好的抗肿瘤活性的证据，其中ACAT1-TPK1-PDH通路参与了诱导分化； CHA是神经母细胞瘤治疗的潜在候选药物。

关键词:神经母细胞瘤；绿原酸；分化； 乙酰辅酶 a 乙酰转移酶；维生素 b1

1.  介绍

 神经母细胞瘤在儿童中发病率很高，是颅外神经系统的实体瘤。它起源于胚胎神经嵴，占儿童恶性肿瘤的8 %[1]. 目前，可用于高危人群的临床疗法是多模态疗法，包括化疗、干细胞移植、手术、放疗、维甲酸治疗和免疫疗法。然而，这些抑制剂都不能抑制肿瘤复发或转移[2,3].因此，迫切需要进一步研究神经母细胞瘤的发病机制和治疗方案。

 癌症和分化停滞之间的关系已经报道了好几年。神经母细胞瘤是一种从未分化的交感神经节细胞发展而来的癌症。因此，分化诱导疗法在这种癌症治疗中是可能的 [4].迄今为止，维甲酸(RA)是最有效的诱导药物神经母细胞瘤分化。用RA处理的神经母细胞瘤细胞系显示出ir-可逆的增殖能力降低和神经母细胞瘤细胞系中神经侵袭形成增加[5].RA衍生物13-顺式RA已迅速进入神经母细胞瘤的临床试验，现已成为标准治疗的一部分[6].基本原理是13-顺式RA诱导残余肿瘤细胞分化，降低患者化疗、手术切除、骨髓移植后复发的风险。然而，该机制尚未完全阐明[7].据报道，约25%的神经母细胞瘤患者出现MYCN扩增(MNA),而MYCN扩增影响细胞分化过程。对于MYCN扩增的神经母细胞瘤患者， 类风湿性关节炎不是一种有效的治疗选择，因为MYCN扩增会导致类风湿性关节炎治疗耐药[8–10].因为神经母细胞瘤增殖、分化和存活的分子机制仍未被探索，所以研究新的分化诱导剂和机制将具有临床益处。绿原酸(CHA)是一种从食物和植物中提取的天然小分子，如杜仲和咖啡。据报道，它是一种基于多羟基苯酚的苯基化合物，可调节免疫肿瘤微环境，并将巨噬细胞从M2型重新极化为M1型，从而抑制肿瘤生长[11].据报道，CHA还可通过降低IL17来缓解红斑狼疮样皮肤病变和关节炎[12].除了对免疫治疗的作用外，研究表明CHA在肝癌和肺癌中具有良好的分化诱导作用， 但其在神经母细胞瘤中的作用尚未见报道[13].此外，我们实验室以前的研究表明，CHA可以抑制乙酰辅酶a乙酰转移酶(ACAT1)的活性，ACAT1在线粒体中特异表达。ACAT1是酮体 代谢和脂肪酸代谢的关键酶[14].据报道，ACAT1以四聚体的形式存在，其中ACAT1的Y407位点可以使四聚体更加稳定并增强其活性，同时破坏ACAT1四聚体的稳定性， 而ACAT1的敲除可以有效控制肿瘤的生长[15].

 在此，我们报道了神经母细胞瘤中CHA的一种新机制。CHA通过抑制ACAT1 在体内和体外诱导神经母细胞瘤细胞的分化。用CHA治疗或消除ACAT1恢复了神经母细胞瘤细胞的氧化磷酸化(OXPHOS)。我们发现CHA上调硫胺素焦磷酸激酶1(TPK1)的表达，后者激活硫胺素代谢途径，增强丙酮酸脱氢酶(PDH)活性，促进神经母细胞瘤细胞分化。

2.   结果

2.1 CHA在体内外诱导神经母细胞瘤细胞分化

 CHA 已在复发性高级别神经胶质瘤患者 中进行了临床评估 ，并显示出初步疗效 [16].CHA可能具有抗神经母细胞瘤的抗肿瘤活性。因此，我们首先研究了CHA对神经母细胞瘤细胞的作用。用CHA处理一周后，5-乙炔基-2 ′-脱氧尿苷(EdU)分析显示，与对照细 胞相比，暴露于CHA的两种细胞系增殖缓慢(图 1a)。令人惊讶的是，两种成神经细胞瘤细胞(Be(2)-M17和SH-SY5Y)显示出明显的形态学变化，包括更长的神经突和更多的分支，以及成熟细胞的迹象(图1b)。CHA处理24h后，细胞周期阻滞在G0/G1期(图1c)。两种细胞类型的迁移和克隆形成能力均弱于对照组(图S1A，B)。然而，JC-1 染色，一种用于检测线粒体膜电位的探针，在CHA刺激后没有显示出变化，忽略了CHA的细胞毒性(图 S1C)。有趣 的是，在存在CHA的情况下，Be(2)-M17和SH-SY5Y 细胞中分化标记物(MAP2和NeuN)在mRNA 和蛋白水平上均上调(图 1d，E)。

 图一。CHA 促进 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞的分化。 (A)获取了 CHA 对 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞的细 胞形态的影响的显微图像。比例尺:100 μm。 (B)通过流式细胞术定量测定 EdU 荧光强度。 (C) CHA 将细胞周期阻滞在 G0/G1 期。 (D)通过实时qPCR 检测用 CHA (5 M 和 25 M)处理 24 小时的两个细胞系 中 MAP2 和 NeuN 的相对 mRNA 水平，n = 3 。 (E)用 CHA (5 M 和 25 M)处理 24 小时的两个细胞系中 MAP2 和 NeuN 的蛋白质 印迹分析 ，n = 3 。对于(C –E) ，与对照组相比 ，* p < 0.05 ，** p < 0.01，*** p < 0.001，以及**** p < 0.0001。

 为了证实这些观察结果，我们评估了CHA的体内抗肿瘤活性。在小鼠异种移植模型中，CHA对Be(2)-M17和SH-SY5Y细胞显示出良好的抗肿瘤活性(图2a –D)。CHA显著抑制了肿瘤的生长，而没有导致体重减轻(图S2A，B)。小鼠原位模型也显示了类似的结果(图S2C)。与对照组相比，CHA组中Ki-67表达的减少和map2分化标记物水平的升高延缓了 肿瘤的生长(图 2e，F)。总之，CHA诱导神经母细胞瘤细胞分化。

2.2.  线粒体ACAT1参与CHA诱导的神经母细胞瘤细胞分化

 在我们之前的研究中，我们发现CHA是线粒体ACAT1的抑制剂(图 S3A)。我们推测线 粒体ACAT1参与了CHA诱导的神经母细胞瘤细胞的分化。因此，线粒体ACAT1在两种细胞 类型中都被敲除。细胞形态类似于用CHA处理的细胞，其中细胞趋于成熟(图3a)。沉默ACAT1延迟了细胞增殖而没有细胞毒性(图S3B，C),并增加了细胞中MAP2的表达(图3b)。一 直以来，ACAT1敲除后肿瘤生长缓慢(图3c，D)。在肿瘤组织中Ki-67的表达降低，而MAP2的表达高度上调(图3e)。这些数据表明线粒体ACAT1参与了神经母细胞瘤细胞的分化。

 图二。CHA 在体内诱导 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 模型的分化。 (A，B)肿瘤体积和肿瘤重量在 Be(2)-M17 模型中，给小鼠施用 CHA (20 mg/kg 和 40 mg/kg，腹膜内)18 天，n = 7。 (C，D)Be(2)-M17 模型中 的肿瘤体积和肿瘤重量；小鼠腹腔注射 CHA (20 mg/kg 和 40 mg/kg)，连续 16 天， n = 6。 (E，F)通 过免疫组织化学分析 Ki67 和 MAP2 的表达，n = 3。比例尺:100 米。对于(A –F)，* p < 0.05，** p < 0.01，** p < 0.001，*表示与对照相比。

 图 3。ACAT1 的敲除促进 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞在体外和体内的分化。 (A)不存在 ACAT1 时 Be(2)- M17 和 SH-SY5Y 细胞的细胞形态学。显微图像被捕获。比例尺:100 μm。 (B)ACA t1 敲除细胞中分化 标记的蛋白质印迹分析。 β-肌动蛋白作为对照，n = 3。 (C，ACAT1 敲除 16 天的 SH-SY5Y 模型中的 肿瘤体积和肿瘤重量，n = 7。 (E)通过免疫组织化学分析 Ki67 和 MAP2 的表达，n = 3。比例尺:100 m。对于(B –E)，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001 和**** p < 0.0001，与向量组相比。

2.3. CHA恢复神经母细胞瘤细胞的OXPHOS能力

 先前的研究报道ACAT1在线粒体中特异表达，并参与能量代谢[14,15].然后，我们使用海马线粒体应激试验检测了CHA处理的细胞中的线粒体代谢特征。如图所示 4a、B，在用CHA处理的两个细胞中，耗氧率(OCR)值显著更高。在ACAT1敲除中也观察到了这些结果 (图4c，D)。这些数据表明，CHA通过抑制ACAT1恢复了神经母细胞瘤细胞中OXPHOS的水 平。

 图 4。CHA 处理和敲除 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞中的 ACAT1 恢复了 OXPHOS。 (A，B)使用 Seahorse Bioscience 细胞外流量分析仪实时监测经 CHA 处理的 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞的 OCR，n = 3。 (C，D)使用 Seahorse Bioscience 细胞外流量分析仪实时监测具有 ACAT1 敲除的 Be(2)-M17 和 SH- SY5Y 细胞的 OCR，n = 3。

2.4. 硫胺素代谢参与ACAT介导的神经母细胞瘤细胞分化

 为了探索 ACAT1 如何通过调节线粒体代谢来影响神经母细胞瘤细胞的分化，我们在缺乏 ACAT1 的情况下对 Be(2)-M17 细胞进行了代谢组学分析，该细胞产生了最显著的分化表型。使 用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析数据，然后根据 t 检验和可变投影重要 性(VIP)值筛选差异代谢物。p < 0.05，VIP > 1.0 的差异代谢物满足采纳标准。与载体组相 比，在正离子模式下，在 shACAT1 #2 中发现了 94 种差异代谢物， PCA 揭示了两组主成分之间的 显著差异(图 5a，B)。

 对这些差异代谢产物的 KEGG 富集分析表明，嘌呤代谢和硫胺素代谢途径被显著激 活，其中硫胺素代谢参与丙酮酸的氧化脱羧，与细胞氧化磷酸化有关，硫胺素本身具有抗 神经炎症作用 16,17](图 5 中文 –英文)。与载体相比，硫胺素在 ACAT1 敲除后显著上调，硫 胺素产生的前体代谢物 5-羟乙基-4-甲基噻唑也是如此(图 5f)。与 ACAT1 敲除的效果一致，CHA 也上调 TPK1 的表达，TP k1 是催化硫胺素转化为硫胺素焦磷酸(TPP)的关键酶，从而激活硫胺 素代谢(图 5g)。由于硫胺素是 PDH 的重要辅因子，我们检测了两种神经母细胞瘤细胞系中 PDH 的活性 。如图所示 5h ，CHA 增强 PDH 酶活性 。在没有 ACAT1 的情况下， 与载体相 比，PDH 的活性也增加了(图 5 )。

 图 5。敲除 ACAT1 激活硫胺素代谢并增强 PDH 活性。 (A)敲除 ACAT1 的 Be(2)-M17 的 PCA 分析，n = 6。 (B)比较不同代谢物的火山图，n = 6。 (C)热图分析，n = 6。 (D，E)代谢途径分析的结果分别显 示在气泡图和矩形树形图中。 (ACAT1 敲除细胞的硫胺素代谢途径中的差异代谢物， n = 6。 (G)在 CHA 处理后，TPK1 的表达增加， n = 3。 (H，I) PDH 活动。用 CHA (5 M 和 25 M)处理或 ACAT1 敲除的Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞， n = 3。对于(F – I)，* p < 0.05，** p < 0.01 和 ***与对照组相比 p < 0.001。

2.5. TPK1促进神经母细胞瘤细胞的分化

 由于硫胺素代谢参与ACAT1介导的神经母细胞瘤细胞分化，而CHA调节 PDH活性，我们重点研究TPK1与神经母细胞瘤细胞分化的关系。PCAT数据库显示，TPK1高表达的神经母细胞瘤患者相应的ACAT1低表达，表明TPK1和ACAT1之间呈负相关(图 6a)。TPK1高表达的患者总体存活率高(图6b)。免疫组织化学显示，与对照组相比，在CHA处理的动物的肿瘤组织中，TPK1的表达明显增加(图6c)。此外，沉默ACAT1后TPK1高度表达(图6d)。接下来，为了证实TPK1是否调节神经母细胞瘤细胞的分化，Be(2)-M17和SH-SY5Y细胞过表达 TPK1。TPK1的过表达增加了分化标记(MAP2)的水平(图 6e)。相反，在缺乏ACAT1的情况下，TPK1的敲除下调了MAP2的表达(图 6f)。在功能上，PDH活性在两种神经母细胞瘤细 胞系中过量表达后增强(图 6g)。这些数据表明，CHA通过硫胺素代谢途径促进神经母细胞 瘤细胞分化(图 6h)。

 图 6。TPK1 促进 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞分化。(ACAT1 数据库显示 ACAT1 与 TPK1 呈负相关。 (B)具有不 同 TPK1 表达的神经母细胞瘤患者总存活率的 Kaplan-Meier 曲线。p 值< 0.05。(C)通过 CHA 处理的肿瘤组 织的免疫组织化学，n = 3 。比例尺:100  μm。 (D)ACA t1 敲低的肿瘤组织的免疫组织化学，n = 3。 (TPK1 在 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞中的过表达，n = 3 。 (F)在 shACAT1 #2 稳定转染的细胞系中敲低 TPK1，n = 3。

 (G)过表达 TPK1 的 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞中的 PDH 活性，n = 3。 (H)ACA t1-TP k1-PDH 途径的 CHA 调节促进神经母细胞瘤分化的模型图。与对照相比，对于 C，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，和**** p < 0.0001。与向量相比，对于(D –G)，* p < 0.05 ，** p < 0.01，*** p < 0.001，以及**** p < 0.0001。

3. 讨论

 由于它是一种天然小分子化合物， CHA 具有优异的安全性和抗肿瘤活性 18].然而， CHA 在 神经母细胞瘤分化中的作用尚未见报道。在这里，我们研究了 CHA 诱导 Be(2)-M17 和 SH- SY5Y 细胞分化的潜力。基于代谢 ACAT1-TPK1-PDH 途径阐明了 CHA 诱导分化的新机制。

 传统上，神经母细胞瘤通常用放射疗法、分子靶向疗法或免疫疗法治疗；但神经母细 胞瘤具有高度异质性，限制了其疗效并导致耐药。 目前，天然产物由于其低毒性也被列为 有希望的候选药物。 例如，异甘草素下调细胞中的 ATP 以诱导细胞死亡[19].姜黄素可诱导 线粒体功能障碍导致细胞死亡，维甲酸可诱导神经母细胞瘤的分化治疗 20,21].据报道， 神经母细胞瘤中 c-MYC 的过度表达阻断了神经母细胞瘤的分化和发育停滞，从而促进了神 经母细胞瘤的恶性表型[22,23].神经母细胞瘤在良好的分化诱导剂的刺激下可以分化为成 熟的神经元。研究表明， 神经元是终末分化的细胞， 其能量完全依赖于 OXPHOS，线粒体功 能障碍导致神经元细胞倾向于死亡[24].我们的研究检测了 CHA 诱导的分化细胞的表型，证 明分化细胞失去了肿瘤细胞的恶性潜能，包括增殖能力下降，周期停滞在 G0/G1 期，迁移 和侵袭能力下降。

 以前的研究表明， 突变型 ACAT1 可以去乙酰化 PDH，抑制肿瘤增殖。因此，ACAT1 被认 为是一种潜在的抗癌药物 25,26].我们的研究表明 CHA 抑制 ACAT1 的酶活性。然而，ACAT1 与神经母细胞瘤分化的关系尚未见报道。在这里，我们报道沉默 ACAT1 促进 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞的分化。

 研究表明， 当干细胞致力于分化时，糖酵解代谢转移到线粒体 OXPHOS，以满足分化细 胞增加的细胞能量需求[27,28].从糖酵解到线粒体氧化磷酸化的代谢转变在干细胞分化中 变得越来越重要 29].“Warburg 效应”确保了肿瘤细胞的能量需求，同时也加速了核酸、脂肪 酸和磷脂的生物合成，以维持肿瘤细胞的生长[30,31].细胞的正常分化主要通过氧化呼吸(三 羧酸循环和氧化磷)获得能量。肿瘤细胞的这种代谢紊乱也提供了有针对性的治疗机会。线 粒体功能被称为“肿瘤抑制因子 ”，其氧化磷酸化的恢复被认为是治疗的目标。抑制糖酵 解的试剂已经进入癌症患者的临床试验[32 –34].在我们的研究中，在 CHA 诱导的分化细胞 和 ACAT1 敲除细胞系中，PDH 活性显著增强，OCR 结果显示 OXPHOS 功能恢复，这表明线粒 体 OXPHOS 恢复可能是驱动神经母细胞瘤分化的重要因素。

 肿瘤环境中的营养可以影响癌细胞的代谢，对癌症的发生发展有一定的影响 35,36]. 硫胺素是一种水溶性维生素，是细胞代谢中四种关键酶活性所必需的，包括 PDH、 α-酮戊 二酸脱氢酶、转酮醇酶和分支 α-酮醇酶脱氢酶复合物 37].硫胺素被转化为活性二磷酸 TPP，这是唯一已知的在 TPK1 作用下作为辅酶因子发挥作用的硫胺素磷酸酯[38,39].在我 们的研究中，代谢组学分析表明，敲除 ACAT1 可以激活硫胺素代谢途径，这归因于 TPK1 表 达的上调，并进一步恢复肿瘤细胞中 PDH 的活性和 OXPHOS 的功能。然而，ACAT1 调节 TPK1 表达的分子机制需要进一步研究。

4. 材料和方法

4.1. 研究方案的伦理批准

 本研究是根据世界医学协会的道德规范(赫尔辛基宣言)以及国家立法和机构指南进行 的。北京协和医学院伦理委员会批准了神经母细胞瘤患者数据分析公共数据库 (YW2018- 018-01)。动物实验由中国医学科学院药物研究所和北京协和医科大学动物实验伦理委员会 批准，并根据北京协和医科大学动物实验指南(00003568)进行。

4.2. 试剂

 本研究中使用的抗体如下 :抗 MAP2 (Abcam ，剑桥 ，英国， ab32454 ，1:1000)；抗 ACAT1(细胞信号技术， 美国马萨诸塞州波士顿，#44276，1:1000)；anti-NeuN(细胞信号技 术，美国马萨诸塞州波士顿，#24307，1:1000)；抗 Ki67(细胞信号技术，美国马萨诸塞州 波 士 顿 ， #9449 ， 1:500) ； 抗 TPK1 (proteintech ， 芝 加 哥 ， IL ， 美 国 ， 10942-1- AP，1:1000)；抗 β-肌动蛋白(ZSGB-BIO，中国北京，TA346894)。CHA 获自九江生化工程技术开发公司(中国四川成都)。在细胞实验中，将用于细胞分析的 CHA 以合适的浓度溶解 在二甲基亚砜(DMSO)中，在动物实验中，将用于注射的 CHA 以所需的浓度溶解在生理盐水 中。

 抗 ACAT1 的短发夹 RNA (shRNA)序列购自 IgeBio(中国广东广州) 。ACAT1-#1 特异性 shRNA  的  靶 序  列 为  5 ′-cgaatgaacaggacgcttatctcggagataaagcgtcctgttcatttcg- 3 ′ ，ACAT1-#2 特异性 shRNA 的靶序列为 5 ′-gcctttagtgtctggttgtactctgagtatagtacaacc  AGACTAAAGGC-3 ′ ；对照(pko. 1-puro)shrna 由 IgeBio 合成。siRNAs靶 向 TPK1 购 自 KeyGEN  BioTech( 中 国 南 京 ) 。 按 照 制 造 商 的 说 明 (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，使用 Lipofectamine 3000 转染试剂转染所有质粒。

4.3. 细胞培养

 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞系从中国北京协和医科大学基础研究所获得。Be(2)-M17 细胞在 DMEM 培养基中培养，SH-SY5Y 细胞在 RPMI-1640 培养基中培养。培养基中添加了 10%胎牛血清(FBS)和适量的青霉素/链霉素(P/S)。细胞在 37℃的培养箱中培养，环境湿度 为 5% CO2。

 通过慢病毒感染构建 shACAT1 稳定的细胞系。简而言之，我们构建了 shACAT1 质粒， 将包装的慢病毒转染到 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞中，然后使用嘌呤霉素筛选获得稳定的 细胞系。

4.4. 公共数据库分析

 神经母细胞瘤 患者 的数据从 PCAT 数据库下载”http://pedtranscriptome.org/? home(2023 年 4 月 24 日访问) ”[40].我们使用 PCAT 数据库分析了神经母细胞瘤患者 TPK1 和 ACAT1 的相关性， 以及 TPK1 对神经母细胞瘤患者存活率的影响。

4.5.蛋白质印迹分析和免疫组织化学

 在含有 1%蛋白酶抑制剂混合物(TargetMol，Boston，MA，USA)的 RIPA 缓冲液(高效) (So- larbo，Suzhou，China)中， 将细胞在冰上完全裂解 30 分钟，然后使用 BCA 蛋白质定 量试剂盒(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)测定蛋白质含量，并基于定量结 果匀浆至相同浓度。等量的蛋白质在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后用湿法转移到 PVDF 膜上。

 PVDF 膜在 5%脱脂乳中封闭 1 小时，然后与相应的第一抗体在 4℃孵育过夜。然后将膜与第 二抗体孵育 1 小时。使用化学发光检测试剂盒(BIORAD，Hercules，CA，USA)观察印迹。

 迅速取出肿瘤组织并在 4%多聚甲醛中固定过夜，然后制备 2 mm 厚的石蜡包埋切片。 通用两步检测试剂盒(ZSVB-BIO，PV-9000)用于免疫组织化学检测。根据制造商的说明， 将 载玻片脱蜡并水合，进行抗原修复，封闭内源性过氧化物酶，在 4 °C 的湿箱中孵育相应的 第一抗体过夜，然后加入反应加强液和第二抗体。DAB 显色和苏木精再染色后，进行脱 水、透明和密封程序，最后在荧光显微镜下拍摄。

4.6. RNA提取和实时RT-PCR

 使用快速 RNA 提取试剂盒(ES Science，上海，中国)提取总细胞 RNA。定量后，将用于 qPCR 的 all-in-First-Strand cDNA synthesis SuperMix(转基因生物技术公司，北京，中国) 用于 cDNA 逆转录合成。最后，使用 SYBR 绿色荧光染料(转基因生物技术公司，中国北京)进行 实时 RT-PCR。执行的循环参数如下所列 :在 95℃初始变性 10 分钟；15 次 95 °C 的 40 个循环；60♀C 为 10s；和 72 摄氏度持续 25 s。

4.7. 迁移分析

 用胰蛋白酶消化用 CHA (5 M 或 25 M)或 ACAT1 敲除处理的细胞，并重悬于含 1% BSA 的培养基中。然后，将 100 L 细胞悬浮液(20，000 个细胞)接种到 Transwell 24 孔板的上 室中(美国马萨诸塞州 Tewksbury 的 Corning Costar ), Transwell 包括多孔聚碳酸酯膜 (孔径为 8 μm)。下室含有 700 升补充有 20% FBS 的培养基。孵育 24 小时后，用 4%多聚甲 醛固定细胞，然后用棉签从滤膜的上表面机械去除。然后用 0.1%结晶紫溶液将细胞染色 15 分钟，用 PBS 洗涤，风干，并在显微镜下成像。

4.8.软琼脂克隆试验

 在这项研究中， 将 1.2%琼脂糖和 2 种培养基以相等的比例混合，然后均匀地滴入六孔 板中，以制备基础凝胶。CHA 处理一周后，收集细胞，将相同数量的细胞(5000)加入相应 的 0.7%琼脂糖和每组 2 种培养基的混合物中。然后，将悬浮液连续加入到六孔板中以制备 上层凝胶，并将其放入细胞培养箱中。过夜温育后，将细胞培养基(200 L)加入六孔板以 避免凝胶干燥。细胞培养两周，并在显微镜下捕捉。

4.9.  流式细胞分析

 使用番石榴 EasyCyte 流式细胞仪(Luminex，Austin，TX，USA)进行 EdU 和细胞周期测 定 。 在 细 胞 增 殖 的 EdU 试 验 中 ， 细 胞 与 预 先 配 制 的 10  M  EdU (Beyotime，Nanjing，China)一起孵育 2.5 小时。EdU 与 click 反应溶液(叠氮化物 594)化 学结合 30 分钟。对于细胞周期评估，用丙啶(PI)对细胞进行染色，并通过流式细胞仪进行 分析。

4.10. ACAT1酶活性测定

 根据之前的研究描述在体外测定 ACAT1 活性[26].总共将 100 ng纯化的 ACAT1 蛋白加 入检测系统，该系统含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.1)、20 mM MgCl2、40 mM KCl、10 M AcCoA 和 60 M CoA。使用 BioTek 分光光度计在 303 nm 的 OD 处测量吸光度。

4.11. 线粒体膜电位测量

 对于线粒体膜电位的检测，JC-1 (Beyotime)用于评估膜电位的变化。细胞在 37℃下 在 JC-1 染色工作溶液中孵育 20 分钟。使用荧光显微镜进行观察。

4.12.代谢组学分析

 收集细胞并从细胞培养基中取出，在预冷的 PBS 中洗涤三次，用胰酶消化，收集到 1.5 mL EP 管中，离心并再次洗涤用于计数，离心后保留细胞团块，然后快速置于液氮中 30 秒并转移 到 80℃保存。后续代谢组学分析由上海百树生物医学技术有限公司(中国上海)委托进行。

4.13.细胞代谢测量

 海马生物科学公司的细胞外流量分析仪(XF24Seahorse Bioscience，CA，USA)用于实 时监测细胞氧化磷酸化。简而言之，将 10，000 个细胞接种在为 XF24 设计的 24 孔板中， 并补充 200 L 合适的生长培养基，并将细胞培养过夜。在测量之前，用含有 10 mM 葡萄 糖、1 mM 丙酮酸钠和 2 mM 谷氨酰胺的 XF DMEM 基础培养基洗涤细胞一次；然后，将 500 L 制备好的 XF DMEM 培养基添加到每个孔中，并在没有 CO2 的情况下孵育 1 小时。然后按照 海马生物科学公司的建议，在混合(2-4 分钟)、静置(2 分钟)和测量(2-4 分钟)的典型的 8 分钟期间测量 OCR。首先记录基线 OCR 水平，然后记录连续使用相关抑制剂后的 OCR 水平 : 寡霉素(0.5 M)、FCCP (1.0 M)和瑞替酮/抗霉素 A (0.5 M)。

4.14.皮下和颅内异种移植神经母细胞瘤模型

 Balb/c 裸鼠(雄性，6-8 周)购自北京 HFK 生物科学有限公司(中国北京)，并保存在无 病原体的动物设施中。小鼠皮下接种 1 106 个 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 细胞。七天后，将小 鼠随机分为三组(n = 7)。三个组每天接受一次赋形剂、20 mg/kg CHA 和 40 mg/kg CHA 的 腹膜内注射，共 14 天。每 3 天用测径器测量肿瘤直径，肿瘤体积计算为 V = 1/2 L W2， 其中 L 是肿瘤的最大长度，W 是肿瘤的最大宽度。将肿瘤解剖并固定在福尔马林中用于免 疫组织化学分析。

 用 5 105 个 SH- SY5Y 细胞建立了神经母细胞瘤原位异种移植模型。 简而言之，在裸鼠 中，用微量注射器在右侧 2 mm、前短膜 0.8×mm 和颅骨下 3.5 mm 处注射 5 L 细胞悬液。三 天恢复期后，将小鼠随机分成 3 组

 并注射生理盐水、20 毫克/千克 CHA 或 40 毫克/千克 CHA(腹膜内注射)，每天一次，持续 14 天。每天测量小鼠的体重，当小鼠体重减少约 20%时，进行 MRI 分析。在扫描中用于优化 灰质/白质对比度的参数如下:T2-透波希瑞， TR/TE = 5000/40；六个平均；20 ° 20 ° 的视 野；和 0.5 毫米的切片厚度。所有的大脑都被扫描了 14 次。将小鼠的大脑解剖并固定在福 尔马林中用于 H&E 染色。

4.15. 统计分析

 所有数据均以平均值±标准差或 SEM 表示。数据用 t 检验或 ANOVA 检验进行分析。使 用 Dunnett 检验进行多重比较和分析。显著性被定义为 p < 0.05。

5. 结论

 总之，我们的研究提出了 CHA 诱导神经母细胞瘤分化的新机制。CHA 通过抑制线粒体 ACAT1 促进神经母细胞瘤分化。ACAT1 的消除上调了 TPK1 的表达，激活了硫胺素代谢，并 恢复了细胞中的 OXPHOS。本研究为 CHA 治疗神经母细胞瘤提供了理论依据， 为神经母细胞 瘤的治疗提供了有吸引力的靶点和方案。

补充材料:以下支持信息可从以下网站下载 https:

//www.mdpi.com/article/10.3390/ph16060877/s1。 图 S1:分化细胞的迁移和侵袭能力下降。； 图 S2: CHA 降低了皮下和原位异种移植模型中的肿瘤负荷；图 S3: CHA 抑制 ACAT1 酶活性。

作者的贡献:概念化， X.-G.C .和 M.J。方法论，S.Y .和 M.-J.W .软件，s . y . t .-t . d .和 n .-n . x；验证，s . y . m . j .和 x .-g . c；形式分析，s . y . z .-y . h .和 W.-D.W .

调查，S.Y .，n-n . x .和 M.J .x-g . c .资源；数据管理、 s . y . m .-j . w . z .-y . h .和 W.-D.W .写作——原始草案准备，S.Y .写作——评论和编辑，M.J .和 x .-g . c；可视化，s . y . z .-y . h .和 T.-T.D .监督，x .-g . c；x-g . c .项目管理； 资助收购，X.-G.C .所有作者 已阅读并同意手稿的出版版本。

资助:本研究由 CAMS 创新基金资助，授权号 2022-I2M-1-014。

机构审查委员会声明 :本研究由(北京协和医科大学)PUMC 制药机构动物护理和使用委员会批准(批准 号:00003568)。

知情同意书:不适用。

数据可用性声明:数据包含在文章或补充材料中。

利益冲突:作者声明没有利益冲突。

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